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细胞活力测定:为什么,是什么以及如何

为什么要测量细胞活力?

细胞活力是一个群体中活细胞比例的度量。细胞活力的测量在所有形式的细胞培养中都起着至关重要的作用。有时,这是实验的唯一目的,例如在细胞毒性试验中。或者,细胞活力可用于将细胞行为与细胞数量相关联,从而提供更准确的细胞代谢图像。不管实验的目的如何,细胞活力都非常重要,并且有几种方法可以准确地评估它。

细胞活力测定–概述

细胞活力测定通常会测量一个反映群体中活的/代谢活跃的细胞数量的参数。他们旨在量化基准线细胞健康状况,并评估对各种治疗和刺激的反应。

死亡和垂死细胞的标志是细胞和核膜的分解。许多活力测定法利用细胞死亡的这种特征来区分生存细胞和非生存细胞。细胞活力测定可以基于比色、荧光和生物发光检测技术。有各种各样的体外细胞活力测定方法,在选择适合您需要的测定方法时要做出多个判断。

染料排除法

通常使用诸如台盼蓝之类的染料排除方法,因为它们便宜又简单。这些是在假定活细胞具有完整细胞膜的情况下开发出来的,如图1所示,该细胞膜将排除染料,而垂死/死细胞由于膜完整性受损而吸收染料。因为该染料对哺乳动物细胞具有极强的毒性,其缺点包括灵敏度低(例如,仍然存活但未丧失细胞功能的细胞)以及事实上是这些是终点检测

图1 -可以通过简单地计数细胞来进行染料排除法,例如台盼蓝试验。一些自动细胞计数器则具有集成的软件来执行此类测定。

比色法

比色测定法基于生化标记物的测量,以评估细胞的代谢活性。 细胞存活率分析MTT,全名是:(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide),是评估细胞活力最常用的比色测定法之一。该测定确定细胞活力作为线粒体功能的反映。如图2所示,MTT分析测量了线粒体脱氢酶对MTT的还原作用,以及由此形成的紫色甲䐶结晶。

图2- MTT测定细胞活力是基于MTT转换为甲䐶结晶的原理,导致发射光谱从黄色变为紫色。

三磷酸腺苷(ATP)-细胞活力测定

只有活细胞可以合成ATP。因此,ATP是代谢活性细胞的指标,并且可用ATP的量来测量培养物中活细胞的数量。 ATP细胞活力测定法是利用萤光素酶催化D-萤光素和ATP形成光的发光测定法。

荧光活细胞成像,提高细胞活力

到目前为止,已描述的所有选项都是需要杀死细胞以获得读数的终点分析。另一种更好的选择是实时(活)细胞活力测定。活细胞成像使用延时显微镜,可以在一段时间内对细胞进行体内成像。

最常用的技术是活细胞荧光显微镜,它使研究人员能够追踪细胞中不同荧光蛋白的定位(参考文献1)。这种实验的第一步是引入荧光报告在感兴趣的细胞系中。在过去的几十年里,基因编码的荧光蛋白标签已经彻底改变了细胞内动力学的分析。最先进的基因组工程工具,如CRISPR,造成更多种类的用于标记蛋白质的荧光报告基因的进一步发展。

然而,荧光活细胞成像过程中的一个常见问题是光毒性的发生。光毒性会在光激发时导致细胞大分子受损,进而反过来会影响样品生理,并可能导致细胞死亡(参考文献2)。尽管不可避免地会出现一定程度的光毒性,但限制其对获得生物样品上可重复的定性和定量数据至关重要。

无标签活细胞成像检测细胞活力

越来越受欢迎的荧光法的替代方法是无标签细胞成像。是非侵入性方法,它们使用延时显微镜和图像分析算法来实时了解细胞健康状况,可以通过例如增长率或迁移速度的比较来评估细胞行为(参考文献3)。非侵入性视频监控的一个好处是,细胞培养可以像在任何常规细胞培养方案中一样生长。请注意,这需要将细胞培养物保持在受控的环境中,在该环境中控制温度、 CO2 和O2的水平(在厌氧室中)。

自动化视频显微镜在评估细胞活力方面具有巨大潜力,比终点活力测定法或基于荧光测定法具有多个优势(参考文献4)。细胞死亡过程总是伴随着特定的形态特征,例如体积和形状变化,可以使用简单的明场视频系统直接观察和捕获这些图像。延时方法不仅可以帮助您检视是否开始细胞凋亡,而且还可以帮助检视细胞何时开始凋亡。

追踪单细胞是实时成像的一个革命性应用。新的方法使用自动跟踪软件进行后期成像。传统跟踪群落中细胞是依赖于静态图像,而静态图像无法提供准确的时间分辨率来识别单个细胞中的行为特征。

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实时视频监控系统(例如CytoSMART Lux2)提供了一种简便且经济高效的方式来实时监控细胞生存能力,而无需标记细胞。

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实时成像技术的图像分析算法不仅可以提供有关生存力,还可以提供有关增殖和决定细胞命运的信息。这些像是谱系追踪活体种群追踪,对于干细胞培养特别有用(参考文献8)。诸如汇合、面积渗透和菌落生长之类的参数,可用于从其他定性视频分析中,生成定量数据。例如汇合度自动化分析,可以提供有关生长和生长速度的动力学信息。

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希望在多孔板中进行无标签测定的研究人员,我们建议使用CytoSMART Omni

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其他无标签的方法包括复杂形式的显微镜,例如数字全息显微镜(DHM)和原子力显微镜(AFM)。 数字全息显微镜(DHM)能够以高灵敏度定量和动态地评估细胞的形状和体积变化(参考文献5);原子力显微镜(AFM)被用作无标签的监测和筛选技术,依细胞粘附力损失评估垂死细胞的记录(参考文献6)。此外,拉曼光谱法是另一种通用工具,可提供目标细胞的分子指纹,可用于以无标签和高通量的方式评估细胞活力(参考文献7)。与常规细胞活力测定相比,无标签方法的显着优势是它们不需要样品制备的几个阶段,从而大大减少了实验完成的时间。

细胞培养的细胞活力分析是生命科学中可靠且值得信赖的方法。虽然以化合物为基础的分析方法,如MTT法已经存在很长时间了,但这些方法往往缺乏动力学方面的洞察力。新方法特别是在(无标签)活细胞成像中,正在作为传统方法的可行替代方法或支持方法。

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