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荧光活细胞成像应用

活细胞成像的优势

实时成像与基于固定终点荧光染色的测定法相比,可以研究随时间变化的细胞过程。 与在给定且通常是人为选择的时间点的单个快照相反,这提供了有关某些生物过程动力学的更完整的信息。 连续监视单元格具有独特的优势:

  • 它可以确定用于终点研究的合适时间点:许多生物学过程需要很长时间(几小时到几周),并且经常选择最重要的时间点进行分析可能会很困难,例如 处理或分化等之后何时收集细胞。能够实时监控细胞的反应,可以更准确地识别相关终点。
  • 随着时间的推移,它提供了生物过程的更多和连续的数据点,从而提供了更强大的定量分析
  • 它可以量化仅在给定时间点就可能错过的瞬时细胞表型变化
  • 它有助于改善对端点研究中冲突结果的解释,这些结果可能是时空动态且可控的可逆过程的结果。

荧光工具的出现开启了生物学研究的新纪元,使我们能够看到和研究以前不可能的细胞过程和动力学。 荧光染料和蛋白质标签(例如绿色荧光蛋白(GFP))可以在单细胞分辨率下监控某些生物过程和动力学,因此使我们能够获得异质性数据,而依靠依赖于收获细胞群的其他方法将无法获得异质性数据 。

活细胞荧光显微镜的关键应用

荧光和活细胞成像的结合已成为现代细胞生物学的重要工具。 利用这两种方法的组合功能有无数种可能性。 下面我们将讨论几个关键应用程序(图1)。


图1.该图突出显示了实时荧光成像的关键应用。 图片由朱莉娅·格里马尔迪(Giulia Grimaldi)提供。

测量细胞健康和生存能力是生物学研究许多领域的基本任务之一,包括分析不同药物治疗,环境变化或对生理系统的任何其他干扰的影响。 不同的荧光探针使我们能够实时测量细胞健康的不同参数。 这些包括细胞毒性,凋亡和增殖测定。

大多数测定生存力的测定的基本原理是评估质膜完整性,作为鉴定死细胞的主要参数。 为了这个目的,使用了不能穿过活细胞的细胞膜并且仅当与核酸结合时才发出荧光的DNA结合荧光团。 不健康或濒临死亡的细胞的膜受损,使染料流入细胞内,在那里染料将与暴露的DNA结合,产生可被检测到的荧光。 这可作为群体中单个细胞活力的指标。 最常用的染料包括碘化丙啶(PI)或均模乙乙染料(EthD-1)。 可以将它们与其他染料(例如Hoechst 33324)复用以检测细胞总数,或将Calcein AM复用以鉴定活细胞。

钙黄绿素AM是通过鉴定培养物中所有活细胞来衡量生存力的荧光染料的一个例子。 钙黄绿素AM本身是一种非荧光,疏水性化合物,可轻松渗透到质膜中。 在细胞质中,它被内源性酯酶裂解,产生强荧光化合物钙黄绿素,该钙黄绿素保留在具有完整膜的细胞中。 由于荧光信号与活细胞数量成正比,因此它也可以用于评估几天内的活细胞数量,因此也可以用作评估细胞增殖率的方法。

视频1.球体培养中的活死成像。 活细胞被染成绿色,球体核心中的垂死细胞显示为红色。

一些荧光染料使我们能够区分细胞死亡的不同阶段,包括早期凋亡细胞和坏死细胞。 诸如恶唑黄(也称为Yo-Pro1)之类的染料是高亲和力的花青素单体核酸染料。 早期的凋亡细胞对该化合物具有渗透性,而它们仍不渗透PI(坏死细胞)。

区分某些疗法或化合物如何激活不同的细胞死亡途径的能力不仅对于药物发现研究至关重要,而且对于更好地了解细胞中的各种生物学过程也至关重要。 不断有新的荧光染料被开发出来,以帮助研究人员分析与细胞死亡相关的不同途径。

一种方法利用caspase3 / 7酶系统可视化凋亡细胞。 已与caspase-3 / 7识别序列偶联的DNA荧光染料可渗透细胞膜。 在凋亡过程中,如果激活了半胱天冬酶3/7,它会切开识别序列,从而释放出荧光团,然后荧光团可以自由结合DNA,从而导致荧光染色。 另一种方法检测磷脂酰丝氨酸(PS)从质膜内层到外层的转运,作为细胞凋亡的标志。 Annexin V是一种PS结合蛋白,可以与更明亮,更稳定的新一代荧光团偶联,从而可以在细胞培养物中可视化该过程(例如,参见视频2)。

视频2.在CHO细胞中诱导的细胞死亡的实时成像。 早期凋亡细胞变为绿色(pSIVA),后来细胞膜崩解(坏死细胞)变为红色(PI)。

更复杂的基因编码的荧光探针(GEFP)使我们能够更详细地监测细胞增殖,并使用Miyawaki等人[1]开发的荧光泛素化细胞周期指示剂(FUCCI)来剖析细胞周期和分裂的不同阶段。 这个聪明的系统利用了标志着特定细胞周期转换的两种振荡蛋白。 两种颜色的探针将G1期核标记为红色,而将S / G2 / M期的核标记为绿色,处于从G1到S过渡阶段的细胞显示为黄色。 因此,该方法允许提高空间和时间分辨率的水平,以研究细胞周期事件响应各种治疗或生理事件的协调性。

作为体外模型,包括3D培养物(例如球体和类器官)或多细胞类型共培养物在内的更复杂的培养模型正变得越来越重要和广泛。荧光标记使我们能够在更复杂的培养中追踪某些细胞亚群的命运,并确定它们如何自我组织,与其他细胞类型相互作用等。可以转染细胞以表达遗传编码的荧光标记,这些荧光标记正在不断合成,并且可以因此更适合于持续时间更长的实验。他们需要额外的转染和细胞选择步骤才能获得合适的品系。对于不能进行转染的短期实验或研究,还有其他可用的“跟踪器”。一些可渗透细胞的荧光染料,例如CMFDA及其变体,是无毒的,可被细胞保留,使细胞的整个细胞质染色。另一个选择是像PKH26或PKH67这样的染料,它们通过将脂肪族报告分子掺入细胞膜脂质双层来染色细胞膜。但是,大多数这些随着每次细胞分裂而被稀释,因此可以进行成像的天数取决于细胞增殖的速度。

图2.神经干细胞(用CMFDA标记为绿色)和内皮细胞(HUVEC,用DiI标记为红色)的共同培养的实时成像。 用不同的荧光团标记两个细胞群可以监测其在培养物中的自组织。

荧光标记使我们能够追踪单个细胞,不仅追踪它们的位置,而且还能追踪迁移以及相关的形态变化。 它们还使我们能够查看和跟踪在非透明材料(例如,不同的支架或水凝胶)上生长的细胞,例如在组织工程或生物材料研究应用中。

细胞器特异的荧光探针使我们能够通过观察不同细胞器及其随时间的动态来追踪单个细胞内的过程。 现在的探针产品组合不仅包括用于核,细胞质和细胞膜等基本结构的标记,还包括用于标记线粒体,细胞骨架蛋白(微管蛋白和肌动蛋白)和利用细胞器特有特性(即膜电位)的溶酶体的特异性标记。 ,结构,pH)以对其进行选择性染色。 它们可用于响应生物学事件实时研究细胞区室,或与其他标签结合使用以确认特定蛋白质的位置或身份。

转染已成为现代分子生物学的基本方法之一。 在转染过程中,将外来遗传物质(DNA或RNA)引入细胞中,以研究基因和蛋白质的功能和调控。

任何转染方案的关键检查点之一是评估该过程的效率。 因此,许多质粒构建体均包含荧光蛋白(GFP,RFP,mCherry等)标签或报道分子,用于可视化该过程的功效。 使用实时成像,可以很容易地跟踪目标蛋白质表达的时间过程,并比较不同转染条件的效率以优化实验设置。

视频3.用XXX转染的XXX细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达的时程。

荧光报告仪与实时成像相结合,为实验设计提供了许多可能性。它们可用于观察和记录特定信号通路的激活,并产生实时动力学数据,以及量化感兴趣基因的表达。在诸如启动子之类的调控元件下游克隆荧光报道分子可用于测量其活性。与传统终点类型的实验荧光素酶测定法相比,实时成像可以产生实时动力学数据。如果将与荧光报告基因偶联的这些调节元件稳定转染到细胞中,它们可以产生特异性的启动子-报告细胞系。这些在例如干细胞研究中非常有用。在干细胞分化过程中某些启动子激活后表达的荧光报告基因可提供有关分化方案效率,实验过程中不同基因表达的时间过程或培养物中存在的不同亚群内的重要数据[2]。

新探针的持续开发正在不断扩展我们可以在活细胞中监测的参数范围。 在过去的几年中,随着信号和代谢过程的发展,新型染料的商业化发展显着。 这些实验使我们可以获得细胞事件的更好的时空分辨率。

例如,缺氧染料用于监测细胞中的氧气水平,并随着氧气水平的降低而增加荧光强度。这可能是一个非常强大的工具,可用于监测3D培养物中的健康和缺氧情况,例如球状和类器官中的低氧浓度可导致坏死核心的形成,或用于研究缺氧对细胞代谢的影响。其他探针能够可视化活细胞中的氧化应激,因为当它们被活性氧(ROS)氧化时会发出荧光。氧化应激涉及许多生物学过程,例如衰老,炎症和某些退行性疾病,并且是由于培养物中产生ROS以及细胞无法充分清除它而引起的。

广泛的GEFP进一步扩大了可能的应用范围。它们通常由荧光蛋白和选择性结构域构建,该结构域可以识别某种分析物或通过信号传导过程进行修饰,从而改变报告基因的荧光特性。一些示例包括细胞内钙探针(GECI),钾离子探针(GEPPI),细胞内pH指示剂,ATP传感器等。此外,现在可以将探针设计为非特异性的或靶向某些细胞器(例如线粒体,ER,溶酶体等)。有关广泛的评论,请参见Depaoli等人(2019)[3]。

设置荧光活细胞成像实验

活细胞荧光成像具有许多优势,并提供了各种实验设计机会。但是,与任何其他方法一样,在设置实验以获得有意义的数据并避免损坏细胞和潜在伪像时,需要考虑一些注意事项。首先,需要在整个实验过程中将细胞维持在生理环境中。一些永生化的细胞系足够健壮,可以在没有任何环境控制的情况下进行短期成像。但是,温度,氧气和二氧化碳(CO2)浓度的变化会导致电池行为的变化并影响观察到的过程。因此,在更长的实验中,可以使用带有加湿加热室和CO2控制的成像系统。然而,适合在培养箱内工作的荧光活细胞成像设备是首选。

染料的选择同样重要。遗传编码的荧光蛋白在培养过程中随着时间的推移更加特异性和稳定。但是,它们确实暗示了细胞的遗传操作,包括此过程可能对细胞生理产生的所有可能的负面影响。对于化学荧光团,需要考虑其对细胞的毒性,通透性和随时间的保留对细胞的影响。取决于荧光显微镜滤光片的设置,选择显然还会受到探针的激发和发射光谱的影响。

最后,在成像过程中,由于细胞暴露于高强度激发光中,因此会产生负面影响。在称为光毒性的过程中,光子通量会产生过多的反应性物种,例如自由基和ROS,从而损害细胞。因此,期望以这样一种方式设计实验,以使细胞所暴露的光(波长范围和光子数)最小化,但同时要优化信噪比。这不仅取决于荧光标记本身的亮度,还取决于荧光显微镜的光源(LED灯与水银灯)。

总而言之,认识到荧光实时显微镜并非完全非侵入性这一概念,可以帮助我们设计实验以最大程度地减少细胞伤害,非生理反应和实验伪影,同时获得有关随时间变化的细胞过程的详细信息。

结论

活细胞荧光显微镜领域的最新进展以及遗传编码的荧光团和化学染料的范围不断扩大,在细胞和分子生物学领域创造了许多新机遇。 此外,可以将不同的测定法进行多重化,为许多创新技术和实验创造了空间,这些技术和实验将使人们对实时的细胞行为和潜在分子过程的动力学有更好的了解。

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